Бактериальный геном состоит из генетических элементов, способных к самостоятельной репликации, т. е. репликонов. Репликонами являются бактериальная хромосома и плазмиды.
Наследственная информация хранится у бактерий в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которые определяют последовательность аминокислот в белке. Каждому белку соответствует свой ген, т. е. дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательности нуклеотидов.
Бактериальная хромосома представлена одной двухцепочечной молекулой ДНК кольцевой формы. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царства Procaryotae варьируют. Бактериальная хромосома формирует компактный нуклеоид бактериальной клетки. Бактериальная хромосома имеет гаплоидный набор генов. Она кодирует жизненно важные для бактериальной клетки функции.
Плазмиды бактерий представляют собой двухцепочечные молекулы ДНК. Они кодируют не основные для жизнедеятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования.
Свойства микроорганизмов, как и любых других организмов, определяются их генотипом , т.е. совокупностью генов данной особи. Термин «геном» в отношении микроорганизмов - почти синоним понятия «генотип».
Фенотип представляет собой результат взаимодействия между генотипом и окружающей средой, т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, так как характер и степень возможных для данной клетки стенотипических изменений определяются набором генов, каждый из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.
В основе изменчивости лежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В связи с этим фенотипическую изменчивость подразделяют на наследственную и ненаследственную.
Ненаследственная (средовая, модификационная) изменчивость обусловлена влиянием внутри- и внеклеточных факторов на проявление генотипа. При устранении фактора, вызвавшего модификацию, данные изменения исчезают.
Наследственная (генотипическая) изменчивость, связанная с мутациями, - мутационная изменчивость. Основу мутации составляют изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, полная или частичная их утрата, т. е. происходит структурная перестройка генов, проявляющаяся фенотипически в виде измененного признака.
Наследственная изменчивость, связанная с рекомбинациями, называется рекомбинационной изменчивостью.
Подвижные генетические элементы.
В состав бактериального генома, как в бактериальную хромосому, так и в плазмиды, входят подвижные генетические элементы. К подвижным генетическим элементам относятся вставочные последовательности и транспозоны.
Вставочные (инсерционные) последовательности IS-элементы - это участки ДНК, способные как целое перемещаться из одного участка репликона в другой, а также между репликонами. Они содержат лишь те гены, которые необходимы для их собственного перемещения - транспозиции: ген, кодирующий фермент транспозазу, обеспечивающую процесс исключения IS-элемента из ДНК и его интеграцию в новый локус, и ген, детерминирующий синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения.
Отличительной особенностью IS-элементов является наличие на концах вставочной последовательности инвертированных повторов. Эти инвертированные повторы узнает фермент транспозаза . Транспозаза осуществляет одноцепочечные разрывы цепей ДНК, расположенных по обе стороны от подвижного элемента. Оригинальная копия IS-элемента остается на прежнем месте, а ее реплицированный дупликат перемещается на новый участок.
Перемещение подвижных генетических элементов принято называть репликативной или незаконной рекомбинацией. Однако в отличие от бактериальной хромосомы и плазмид подвижные генетические элементы не являются самостоятельными репликонами, так как их репликация - составной элемент репликации ДНК репликона, в составе которого они находятся.
Известно несколько разновидностей IS-элементов, которые различаются по размерам и по типам и количеству инвертированных повторов.
Транспозоны - это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элементы, но имеющие структурные гены, т. е. гены, обеспечивающие синтез молекул, обладающих специфическим биологическим свойством, например токсичностью, или обеспечивающих устойчивость к антибиотикам.
Перемещаясь по репликону или между репликонами, подвижные генетические элементы вызывают:
1. Инактивацию генов тех участков ДНК, куда они, переместившись, встраиваются.
2. Образование повреждений генетического материала.
3. Слияние репликонов, т. е. встраивание плазмиды в хромосому.
4. Распространение генов в популяции бактерий, что может приводить к изменению биологических свойств популяции, смене возбудителей инфекционных заболеваний, а также способствует эволюционным процессам среди микробов.
Изменения бактериального генома, а следовательно, и свойств бактерий могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций.
В середине 70-х г. XX в. открыты подвижные генетические элементы. Они представляют собой сегменты ДНК, способные к транспозиции (перемещению) в пределах одного либо разных геномов. По степени сложности строения различают три типа мигрирующих генетических элементов: IS-элементы (от англ, insertion sequence - вставочные последовательности), транспозоны (Tn-элементы) и некоторые бактериофаги, в частности фаг Мю.
Простейшими генетическими структурами, способными к транспозиции, являются IS-элементы. Размер их составляет в среднем 750-1500 пар нуклеотидов (п. н.). Они содержат только гены, обеспечивающие их собственное перемещение. В структуре IS-элементов различают центральную часть и ограничивающие (фланкирующие) концевые повторы. В центральной части расположены гены, кодирующие синтез белков, необходимых для транспозиции. Концевые участки представлены повторяющимися нуклеотидными последовательностями, длиной 8-40 п. н. Повторения имеют противоположную друг другу ориентацию и называются инвертированными (перевернутыми) повторами. Они служат отличительным признаком различных мигрирующих генетических элементов.
Структура концевых повторов определяет размеры дупликаций (удвоение) ДНК в местах внедрения IS-элементов. Так, IS 1-элемент, обнаруженный в составе хромосомы Е. coli-K12, состоит из 768 п. н., образующих на концах инвертированные повторы длиной по 30 п. н. каждый. Всякий IS-элемент имеет свою нуклеотидную последовательность и может в любой ориентации включаться в ДНК бактерий, плазмид и фагов, вызывая инактивацию отдельных структурных генов и, как следствие, мутации генома или нарушая регуляторные функции оперона. В бактериальной хромосоме может содержаться одновременно несколько копий одного и того же IS-элемента. Перемещение IS- элементов индуцирует разные виды хромосомных перестроек - дупликации, инверсии, делеции.
Транспозоны, или Tn-элементы - подвижные генетические элементы содержат гены фенотипических свойств бактерий и гены
собственной транспозиции. Они способны внедряться в разные участки хромосомы или во внехромосомные генетические структуры. Транспозоны отличаются от IS-элементов более сложной организацией, а некоторые содержат в своем составе IS-элементы.
Транспозоны разделяют на два класса: А и Б (рис. 10.4). Транспозоны класса А (Тп 5) в центральной части содержат структурные гены, которые детерминируют фенотипические свойства, например, устойчивость бактерий к антибиотикам, а гены транспозиции содержатся в составе концевых инвертированных повторов, которыми являются IS-элементы. У транспозонов класса Б (Тп 3) в центральной части содержатся не только гены фенотипических признаков, но и гены транспозиции. Концевые повторы их значительно короче и не могут выполнять функции транспозиции. Эти функции выполняют два гена центральной части. Различия между транспозонами класса А и класса Б состоят также в размерах образуемых дупликаций при внедрении их в плазмиды или хромосомы: первые образуют дупликации 9 нуклеотидных пар, вторые - только 5.
Рис. 10.4. Схема структуры транспозонов класса А и класса Б: ИП - инвертированные повторы; ГТ - гены транспозиций; ГФП - гены фенотипических признаков
Транспозоны имеют значительно большие размеры, чем IS- элементы и составляют в среднем 3 500-15 000 пар нуклеотидов. Так, общая протяженность транспозона Тп 5 составляет 5 800 п. н., из них по 1 500 п. н. приходится на инвертированные концевые повторы. Тп 5 кодирует пять белков. Из них один белок кодирует центральная часть и по два белка - концевые повторы. Транспозон Тп 5 детерминирует устойчивость к канамицину, неомицину и другим родственным антибиотикам.
Следствием перемещения транспозонов, как и IS-элементов, могут быть различные хромосомные перестройки: делеции, инверсии, транслокации, дупликации. Помимо них, перемещение транспозонов между двумя различными репликонами (двумя плазмидами, или плазмидой и хромосомой) может вызывать слияние этих репликонов с образованием коинтегратов. Последующая сайт-специфи- ческая рекомбинация приводит к разделению коинтеграта на два репликона с включением в каждый репликон по одной копии транс- позона. Регуляция транспозиции осуществляется собственными генами МГЭ и хромосомными генами бактерий-хозяев.
Умеренный фаг Мю, выделенный в 1963 г. из культуры холерного вибриона, также обладает свойствами МГЭ. Однако, в отличие от IS-элементов и транспозонов он не содержит на концах генома ни прямых, ни инвертированных нуклеотидных последовательностей. Концевые повторы фага Мю составляют фрагменты ДНК клетки-хозяина, в которой развивался фаг. ДНК клетки прикрепляется к геному фага при его размножении и теряется в ходе его интеграции в новый сайт. Уникальной способностью фага Мю является перенос генов бактерий в различные участки хромосомы или плазмиды клетки-реципиента. Фаг Мю осуществляет постоянную транспозицию в ходе всего литического цикла. Он не обладает специфичностью в отношении локуса хромосомы и может спонтанно внедряться в разные участки вдоль всей хромосомы, вызывая мутации хромосомных генов. За высокую активность индуцировать мутации он получил название Мю (от англ, mutator).
Несмотря на некоторые различия в структурной организации, общим свойством МГЭ является их способность внедряться во множество участков хромосомной или плазмидной ДНК, вызывая мутации и различные генные перестройки. МГЭ служат также специфическими сайтами внедрения плазмид в хромосомы. Через посредство МГЭ осуществляется рекомбинация между негомологичными ДНК. Временную область гомологии создают МГЭ,
включаясь в тот или иной участок хромосомной или плазмидной
ДНК.
Мигрирующие генетические элементы, индуцируя генные и хромосомные перестройки, вносят существенный вклад в перераспределение генетической информации, обеспечивают бактериям селективные преимущества в определенных условиях существования, оказывают существенное влияние на развитие и эволюцию микробных видов.
В качестве мутагенных факторов биологической природы рассматривают мобильные (= мигрирующие ) генетические элементы бактерий – дискретные сегменты ДНК, способные к самостоятельному перемещению из одного участка в другой в пределах репликона, а также к перемещению из одного репликона (хромосомного, плазмидного или фагового) в другой. К таким элементам относятся: простые вставочные последовательности (IS-элементы), транспозоны (Tn-элементы) и фагитранспозоны (Mu, Д3112 и др.). Интеграция их в репликоны происходит независимо от системы общей рекомбинации клеток, которая требует обязательной гомологии у рекомбинирующих структур.
IS-элементы представляют собой линейные фрагменты двухцепочечной ДНК длиной от 200 до 2000 п. н. Они содержат только гены tnp , кодирующие синтез фермента транспозазы, необходимого для их миграции (транспозиции). По концам IS-элементов расположены инвертированные терминальные повторы (ITR). У разных IS-элементов длина концевых повторов ITR варьирует от 8 до 40 п. н. Инвертированные повторы также принимают участие и важны для транспозиции. Схематично строение IS- элемента можно изобразить следующим образом:
Различают несколько типов IS-элементов: IS1, IS2, IS3, IS4 и др. Они отличаются друг от друга по длине и структурой концевых повторов.
IS-элементы являются нормальными компонентами бактериальных хромосом и плазмид. В разных репликонах может содержаться различное, и часто множественное, число копий IS-элементов. IS-элементы могут перемещаться из одного участка генома в другой, например, из бактериальной хромосомы в плазмиду или от плазмиды к плазмиде. Также они могут встраиваться в пределах одного гена и инактивировать его или изменять его регуляцию.
Транспозоны – сложные мигрирующие элементы. Обозначаются как Tn 1, Tn 2,… Tn100, Tn 1002 и т.д. От IS-элементов они отличаются тем, что кроме генов, ответственных за транспозицию, содержат структурные гены, которые отвечают за проявление какого-либо фенотипа. Транспозоны могут контролировать резистентность к антибиотикам и ионам тяжелых металлов, способность к катаболизму лактозы, раффинозы, деградации толуола, синтезу энтеротоксинов и т. п., поэтому их легче обнаружить, чем IS-элементы. Длина транспозонов свыше 2000 п. н. Как и IS-элементы, транспозоны имеют инвентированные концевые повторы (ITR), которыми часто служат IS-элементы. Транспозоны различают не только по строению и составу, но и по степени специфичности при выборе мест интегрирования в репликоны. Однако следует отметить, что специфичность транспозиции одного и того же транспозона для разных видов бактерий и репликонов может быть различной.
Частота миграции транспозонов и IS-элементов происходит с вероятностью 10 –4 –10 –7 на одно деление бактериальной клетки. Она может зависеть от характера донорного и реципиентного репликонов, а также от генома клетки-хозяина. Кроме того, на перемещение транспозонов могут влиять факторы внешней среды (температура, УФ-лучи, химические соединения и др.). Механизмы перемещения транспозонов окончательно не изучены.
Бактериофаг Mu относится к умеренным бактериофагам. Характерной его особенностью является мутагенность, что отражено в названии Mu (mu tator ). Этот бактериофаг был впервые обнаружен у бактерий E. coli , но он размножается также на клетках Shigella , Klebsiella , Pseudomonas , Citrobacter , Salmonella и др. Он причисляется к мобильным генетическим элементам, так как во многих отношениях сходен с IS-элементами и транспозонами и отличается, по существу, только тем, что может формировать вирусные частицы. Сходство с IS-элементами и транспозонами в первую очередь выражается в том, что геном фага Mu (линейная двуспиральная ДНК – 38 т. п. н.) также имеет на концах инвертированные повторы, но только всего из двух нуклеотидных пар.
Попытки отсеквенировать геном гигантской серной бактерии Achromatium oxaliferum дали парадоксальный результат: оказалось, что каждая бактериальная клетка содержит не один, а множество различающихся геномов. Уровень внутриклеточного генетического разнообразия A. oxaliferum сопоставим с разнообразием многовидового бактериального сообщества. По-видимому, различающиеся хромосомы размножаются в разных участках цитоплазмы, подразделенной крупными кальцитовыми включениями на множество слабо сообщающихся отсеков (компартментов). Важную роль в поддержании внутреннего генетического разнообразия играют многочисленные мобильные генетические элементы, способствующие переносу генов с хромосомы на хромосому. Авторы открытия предполагают, что естественный отбор у этого уникального организма идет не столько на уровне клеток, сколько на уровне отдельных компартментов внутри одной гигантской клетки.
1. Загадочная бактерия
Гигантская серная бактерия Achromatium oxaliferum была открыта еще в XIX веке, однако ее биология до сих пор остается загадочной - во многом потому, что ахроматиум не поддается культивированию в лаборатории. Клетки ахроматиума могут достигать 0,125 мм в длину, что делает его крупнейшей из пресноводных бактерий (в морях есть еще более крупные серные бактерии, такие как Thiomargarita , о которой рассказано в новости Древнейшие докембрийские эмбрионы оказались бактериями? , «Элементы», 15.01.2007).
Achromatium oxaliferum живет в донных осадках пресных озер, где он обычно встречается на границе кислородной и бескислородной зон, но проникает и в полностью бескислородные слои. Другие разновидности (или виды) ахроматиума обитают в минеральных источниках и в соленых осадках приливно-отливных маршей .
Ахроматиум получает энергию за счет окисления сероводорода сначала до серы (которая хранится в виде гранул в цитоплазме), а затем и до сульфатов. Он способен к фиксации неорганического углерода, но может усваивать и органические соединения. Неясно, способен ли он обходиться только автотрофным метаболизмом или ему необходима органическая подкормка.
Уникальной особенностью ахроматиума является наличие в его клетках многочисленных крупных включений коллоидного кальцита (рис. 1). Зачем это нужно бактерии и какую роль играет карбонат кальция в его метаболизме, точно не известно, хотя есть правдоподобные гипотезы (V. Salman et al., 2015. Calcite-accumulating large sulfur bacteria of the genus Achromatium in Sippewissett Salt Marsh).
Цитоплазма ахроматиума ютится в просветах между кальцитовыми гранулами, которые фактически подразделяют ее на множество сообщающихся отсеков (компартментов). Хотя отсеки и не изолированы полностью, обмен веществом между ними, по-видимому, затруднен, тем более что у прокариот гораздо слабее, чем у эукариот, развиты системы активного внутриклеточного транспорта.
И вот теперь выяснилось, что кальцитовые гранулы - не единственная уникальная особенность ахроматиума. И даже не самая поразительная. В статье, опубликованной в журнале Nature Communications , немецкие и британские биологи сообщили о парадоксальных результатах, к которым привели попытки прочесть геномы индивидуальных клеток A. oxaliferum из донных отложений озера Штехлин (Stechlin) на северо-востоке Германии. Результаты эти настолько необычны, что в них трудно поверить, хотя оснований сомневаться в их достоверности, по-видимому, нет: работа выполнена в методологическом отношении очень тщательно.
2. Подтверждение полиплоидности
Хотя ахроматиум, как уже говорилось, относится к некультивируемым бактериям, это неудобство отчасти компенсируется гигантскими размерами клеток. Их отлично видно в световой микроскоп даже при небольшом увеличении, и их можно отбирать вручную из проб донных осадков (предварительно пропущенных через фильтр, чтобы удалить крупные частицы). Именно так авторы и собирали материал для своего исследования. Клетки A. oxaliferum покрыты органическим чехлом, на поверхности которого кишат разнообразные сожители - мелкие бактерии. Всю эту сопутствующую микробиоту авторы тщательно смывали с отобранных клеток, чтобы уменьшить долю посторонней ДНК в пробах.
Для начала исследователи покрасили клетки ахроматиума специальным флуоресцентным красителем для ДНК, чтобы понять, сколько в клетке генетического материала и как он распределен. Оказалось, что молекулы ДНК не приурочены к какому-то одному участку цитоплазмы, а образуют множество (в среднем около 200 на клетку) локальных скоплений в просветах между гранулами кальцита (рис. 1, b, d).
Учитывая всё, что известно на сегодняшний день о крупных бактериях и их генетической организации, этого факта уже достаточно, чтобы считать доказанным, что A. oxaliferum является полиплоидом, то есть в каждой его клетке содержится не одна, а множество копий генома.
Впрочем, задним числом и так понятно, что такая огромная прокариотическая клетка не могла бы обойтись единственной копией. Ее бы просто не хватило, чтобы обеспечить всю клетку необходимыми для синтеза белка транскриптами .
Судя по тому, что скопления ДНК различаются по яркости флуоресценции, эти скопления, скорее всего, содержат разное количество хромосом. Здесь нужно оговориться, что обычно весь геном прокариотической клетки помещается на одной кольцевой хромосоме. Для ахроматиума это не доказано, но весьма вероятно. Поэтому авторы для простоты пользуются термином «хромосома» как синонимом термина «одна копия генома», и мы поступим так же.
На данном этапе ничего сенсационного еще не было обнаружено. Прошли те времена, когда все думали, что у прокариот всегда или почти всегда только одна кольцевая хромосома в каждой клетке. Сегодня уже известно много видов полиплоидных бактерий и архей (см. , «Элементы», 14.06.2016).
3. Метагеном многовидового сообщества - в одной клетке
Чудеса начались, когда авторы приступили к выделению ДНК из отобранных и отмытых клеток и к секвенированию. Из 10 000 клеток был получен метагеном (см. Метагеномика), то есть множество (около 96 млн) коротких отсеквенированных случайных фрагментов хромосом (ридов), принадлежащих разным индивидуумам и в совокупности дающих представление о генетическом разнообразии популяции.
Затем исследователи приступили к секвенированию ДНК из индивидуальных клеток. Сначала из 27 клеток были выделены фрагменты гена 16s-рРНК, по которому принято классифицировать прокариот и по которому обычно определяют присутствие того или иного вида микробов в анализируемой пробе. Практически все выделенные фрагменты принадлежали ахроматиуму (то есть примерно совпадали с последовательностями 16s-рРНК ахроматиума, уже имеющимися в генетических базах данных). Из этого следует, что изучаемая ДНК не была загрязнена генетическим материалом каких-то посторонних бактерий.
Оказалось, что каждая клетка A. oxaliferum, в отличие от подавляющего большинства других прокариот, содержит не один, а несколько различающихся вариантов (аллелей) гена 16s-рРНК. Точное число вариантов определить трудно, потому что мелкие различия могут объясняться ошибками секвенирования, а если считать «разными» только сильно различающиеся фрагменты, то встает вопрос, насколько сильно они должны различаться. С использованием самых строгих критериев получилось, что в каждой клетке присутствует примерно 4–8 разных аллелей гена 16s-рРНК, причем это минимальная оценка, а на самом деле их, скорее всего, больше. Это резко контрастирует с ситуацией, характерной для других полиплоидных прокариот, у которых, как правило, на всех хромосомах одной клетки сидит один и тот же вариант данного гена.
Более того, оказалось, что аллели гена 16s-рРНК, присутствующие в одной и той же клетке A. oxaliferum , нередко образуют весьма далекие друг от друга веточки на общем генеалогическом дереве всех вариантов этого гена, обнаруженных (ранее и сейчас) у A. oxaliferum. Иными словами, аллели 16s-рРНК из одной клетки не более родственны друг другу, чем аллели, взятые наугад из разных клеток.
Наконец, авторы провели тотальное секвенирование ДНК из шести индивидуальных клеток. Для каждой клетки было прочтено примерно по 12 млн случайных фрагментов - ридов. В нормальной ситуации этого с избытком хватило бы, чтобы при помощи специальных компьютерных программ собрать из ридов, используя их перекрывающиеся части, шесть весьма качественных (то есть прочтенных с очень высоким покрытием, см. Coverage) индивидуальных геномов.
Но не тут-то было: хотя практически все риды бесспорно принадлежали ахроматиуму (примесь посторонней ДНК была пренебрежимо малой), прочтенные фрагменты наотрез отказались собираться в геномы. Дальнейший анализ прояснил причину неудачи: оказалось, что фрагменты ДНК, выделенные из каждой клетки, в действительности принадлежат не одному, а множеству довольно сильно различающихся геномов. Фактически то, что авторы получили из каждой отдельной клетки, представляет собой не геном, а метагеном. Подобные наборы ридов обычно получают при анализе не одного организма, а целой популяции, обладающей к тому же высоким уровнем генетического разнообразия.
Этот вывод был подтвержден несколькими независимыми способами. В частности, известны десятки генов, которые практически всегда присутствуют в бактериальных геномах в единственном экземпляре (single copy marker genes). Эти однокопийные маркерные гены широко используются в биоинформатике для проверки качества сборки геномов, оценки числа видов в метагеномных пробах и других подобных задач. Так вот, в геномах (или «метагеномах») индивидуальных клеток A. oxaliferum большая часть этих генов присутствует в виде нескольких различающихся копий. Как и в случае с 16s-рРНК, аллели этих однокопийных генов, находящиеся в одной клетке, как правило, не более родственны друг другу, чем аллели из разных клеток. Уровень внутриклеточного генетического разнообразия оказался сопоставим с уровнем разнообразия всей популяции, оцененным на основе метагенома 10 000 клеток.
Современная метагеномика уже располагает методами, позволяющими из множества разнородных обрывков ДНК, обнаруженных в пробе, выделить фрагменты, с большой вероятностью принадлежащие одному и тому же геному. Если таких фрагментов наберется достаточно много, то из них можно собрать значительную часть генома и даже полный геном. Именно таким способом недавно был открыт и подробно охарактеризован новый надтип архей - асгардархеи (см. Описан новый надтип архей, к которому относятся предки эукариот , «Элементы», 16.01.2017). Авторы применили эти методы к «метагеномам» индивидуальных клеток A. oxaliferum. Это позволило выявить в каждом «метагеноме» по 3–5 наборов генетических фрагментов, соответствующих, скорее всего, индивидуальным кольцевым геномам (хромосомам). Или, скорее, каждый такой набор соответствует целой группе похожих друг на друга геномов. Число различающихся геномов в каждой клетке A. oxaliferum скорее всего больше, чем 3–5.
Уровень различий между геномами, присутствующими в одной и той же клетке A. oxaliferum , примерно соответствует межвидовому: бактерии с таким уровнем различий, как правило, относятся к разным видам одного рода. Иными словами, генетическое разнообразие, присутствующее в каждой отдельной клетке A. oxaliferum, сопоставимо даже не с популяцией, а с многовидовым сообществом. Если бы ДНК из одной-единственной клетки ахроматиума анализировали современными методами метагеномики «вслепую», не зная, что вся эта ДНК происходит из одной клетки, то анализ бы однозначно показал, что в пробе присутствует несколько видов бактерий.
4. Внутриклеточный перенос генов
Итак, у A. oxaliferum обнаружен принципиально новый, прямо-таки неслыханный тип генетической организации. Безусловно, открытие порождает массу вопросов, и прежде всего вопрос «как такое вообще может быть?!»
Не будем рассматривать самый неинтересный вариант, состоящий в том, что всё это - результат грубых ошибок, допущенных исследователями. Если так, мы скоро об этом узнаем: Nature Communications - журнал серьезный, исследование захотят повторить другие коллективы, так что вряд ли опровержение заставит себя долго ждать. Гораздо интереснее обсудить ситуацию, исходя из допущения, что исследование проведено тщательно и результат достоверен.
В таком случае нужно прежде всего попытаться выяснить причины обнаруженного у A. oxaliferum беспрецедентного внутриклеточного генетического разнообразия: как оно формируется, почему оно сохраняется, и как сам микроб при этом ухитряется выжить. Все эти вопросы - очень непростые.
У всех остальных изученных на сегодняшний день полиплоидных прокариот (в том числе у известной читателям «Элементов» солелюбивой археи Haloferax volcanii ) все копии генома, присутствующие в клетке, сколько бы их ни было, очень похожи друг на друга. Ничего похожего на колоссальное внутриклеточное разнообразие, обнаруженное у A. oxaliferum, у них не наблюдается. И это отнюдь не случайность. Полиплоидность дает прокариотам ряд преимуществ, однако она способствует бесконтрольному накоплению рецессивных вредных мутаций, что в конечно счете может привести к вымиранию (подробнее см. в новости Полиплоидность предков эукариот - ключ к пониманию происхождения митоза и мейоза , «Элементы», 14.06.2016).
Чтобы избежать накопления мутационного груза, полиплоидные прокариоты (и даже полиплоидные пластиды растений) активно используют генную конверсию - асимметричный вариант гомологичной рекомбинации , при котором два аллеля не меняются местами, переходя с хромосомы на хромосому, как при кроссинговере , а один из аллелей замещается другим. Это ведет к унификации хромосом. Благодаря интенсивной генной конверсии вредные мутации либо быстро «затираются» неиспорченной версией гена, либо переходят в гомозиготное состояние, проявляются в фенотипе и отбраковываются отбором.
У A. oxaliferum генная конверсия и унификация хромосом, скорее всего, тоже происходят, но не в масштабах всей клетки, а на уровне отдельных «компартментов» - просветов между гранулами кальцита. Поэтому в разных частях клетки накапливаются разные варианты генома. Авторы проверили это при помощи избирательного окрашивания разных аллельных вариантов гена 16s-рРНК (см. Fluorescent in situ hybridization). Выяснилось, что в разных частях клетки концентрация разных аллельных вариантов действительно различается.
Впрочем, этого еще недостаточно, чтобы объяснить высочайший уровень внутриклеточного генетического разнообразия, обнаруженный у A. oxaliferum . Авторы видят его главную причину в высоких темпах мутагенеза и внутриклеточных геномных перестроек. Сравнение фрагментов хромосом из одной и той же клетки показало, что эти хромосомы, по-видимому, живут очень бурной жизнью: постоянно мутируют, перестраиваются и обмениваются участками. У A. oxaliferum из озера Штехлин резко повышено число мобильных генетических элементов по сравнению с другими бактериями (в том числе и с ближайшими родственниками - ахроматиумами из соленых маршей, у которых уровень внутриклеточного разнообразия, судя по предварительным данным, гораздо ниже). Активность мобильных элементов способствует частым геномным перестройкам и переносу участков ДНК с одной хромосомы на другую. Авторы даже придумали для этого специальный термин: «внутриклеточный перенос генов» (intracellular gene transfer, iGT), по аналогии со всем известным горизонтальным переносом генов (HGT).
Одно из ярких свидетельств частых перестроек в хромосомах A. oxaliferum - различающийся порядок генов в разных версиях генома, в том числе и в пределах одной клетки. Даже в некоторых консервативных (редко меняющихся в ходе эволюции) оперонах отдельные гены иногда располагаются в разной последовательности на разных хромосомах в пределах одной клетки.
На рисунке 2 схематично показаны основные механизмы, которые, по мнению авторов, создают и поддерживают высокий уровень внутриклеточного генетического разнообразия у A. oxaliferum .
5. Внутриклеточный отбор
Частые перестройки, внутриклеточный перенос генов, высокий темп мутагенеза - даже если всё это и может худо-бедно объяснить высокое внутриклеточное генетическое разнообразие (а я думаю, что не может, об этом мы поговорим ниже), то остается неясным, как ухитряется ахроматиум в таких условиях сохранять жизнеспособность. Ведь подавляющее большинство ненейтральных (влияющих на приспособленность) мутаций и перестроек должны быть вредными! Полиплоидные прокариоты и без того обладают повышенной склонностью к накоплению мутационного груза, а если мы допустим еще и сверхвысокие темпы мутагенеза, становится и вовсе непонятно, как такая тварь, как ахроматиум, может существовать.
И тут авторы выдвигают поистине новаторскую гипотезу. Они предполагают, что естественный отбор у ахроматиума действует не столько на уровне целых клеток, сколько на уровне отдельных компартментов - слабо сообщающихся просветов между гранулами кальцита, в каждом из которых, наверное, размножаются свои варианты генома.
На первый взгляд предположение может показаться диким. Но если подумать, почему бы и нет? Для этого достаточно допустить, что каждая хромосома (или каждое локальное скопление похожих хромосом) имеет ограниченный «радиус действия», то есть белки, закодированные в этой хромосоме, синтезируются и работают в основном в ее ближайших окрестностях, а не размешиваются равномерно по всей клетке. Скорее всего, так оно и есть. В таком случае те компартменты, где находятся более удачные хромосомы (содержащие минимум вредных и максимум полезных мутаций), будут быстрее реплицировать свои хромосомы, их будет становиться больше, они начнут распространяться внутри клетки, постепенно вытесняя менее удачные копии генома из соседних компартментов. Вообразить такое в принципе можно.
6. Внутриклеточное генетическое разнообразие нуждается в дополнительных объяснениях
Идея об интенсивном внутриклеточном отборе геномов, отвечая на один вопрос (почему ахроматиум не вымирает при таком высоком темпе мутагенеза), тут же создает другую проблему. Дело в том, что благодаря такому отбору более удачные (быстрее реплицирующиеся) копии генома должны вытеснять внутри клетки менее удачные копии, неизбежно снижая при этом внутриклеточное генетическое разнообразие. То самое, которое мы с самого начала хотели объяснить.
Более того, очевидно, что внутриклеточное генетическое разнообразие должно резко снижаться при каждом клеточном делении. Разные хромосомы сидят в разных компартментах, поэтому при делении каждая дочерняя клетка получит не все, а только некоторые варианты генома, имеющиеся у материнской клетки. Это видно даже на рис. 2.
Внутриклеточный отбор плюс компартментализация геномов - два мощных механизма, которые должны сокращать внутреннее разнообразие настолько быстро, что никакой мыслимый (совместимый с жизнью) темп мутагенеза не сможет этому противостоять. Таким образом, внутриклеточное генетическое разнообразие остается необъясненным.
Обсуждая полученные результаты, авторы неоднократно ссылаются на нашу работу, о которой рассказано в новости Полиплоидность предков эукариот - ключ к пониманию происхождения митоза и мейоза . В частности, они упоминают, что полиплоидным прокариотам очень полезно обмениваться генетическим материалом с другими клетками. Однако они полагают, что в жизни ахроматиума межклеточный генетический обмен не играет большой роли. Это обосновывается тем, что в метагеноме ахроматиума хотя и обнаружены гены для поглощения ДНК из внешней среды (трансформации, см. Transformation), но нет генов для конъюгации (см. Bacterial conjugation).
На мой взгляд, генетическая архитектура ахроматиума указывает не на конъюгацию, а на более радикальные способы смешивания генетического материала разных особей, такие как обмен целыми хромосомами и слияние клеток. Судя по полученным данным, с генетической точки зрения клетка A. oxaliferum представляет собой нечто вроде прокариотического плазмодия или синцития, вроде тех, что образуются в результате слияния множества генетически разнородных клеток у слизевиков . Напомним, что ахроматиум - бактерия некультивируемая, поэтому не исключено, что какие-то элементы ее жизненного цикла (такие как периодическое слияние клеток) могли ускользнуть от внимания микробиологов.
В пользу того, что внутриклеточное генетическое разнообразие ахроматиума формируется не внутриклеточно, свидетельствует один из главных фактов, обнаруженных авторами, а именно то, что находящиеся в одной клетке аллели многих генов образуют далекие друг от друга ветви на филогенетическом дереве. Если бы всё внутриклеточное разнообразие аллелей формировалось внутри клонально размножающихся клеток, не меняющихся друг с другом генами, то следовало бы ожидать, что аллели в пределах клетки будут более родственны друг другу, чем аллели из разных клеток. Но авторы убедительно показали, что это не так. В общем, я бы поставил на то, что в жизненном цикле ахроматиума присутствует слияние клеток. Это представляется самым экономным и правдоподобным объяснением колоссального внутриклеточного генетического разнообразия.
В заключительной части статьи авторы намекают, что генетическая архитектура ахроматиума может пролить свет на происхождение эукариот. Они формулируют это так: «Между прочим, Марков и Казначеев предположили, что, подобно ахроматиуму из озера Штехлин, клетки прото-эукариот могли быть быстро мутирующими, разнообразящими свои хромосомы, полиплоидными бактериями/археями ». Совершенно верно, но мы также показали, что такое существо не могло бы выжить без интесивного межорганизменного генетического обмена. Будем надеяться, что дальнейшие исследования прольют свет на оставшиеся неразгаданными загадки ахроматиума.